隨著CRISPR-Cas技術(shù)的問世，人類改造、編輯生物基因密碼的腳步大大加快。有了這把趁手的“基因魔剪”，人類可以對基因進(jìn)行高效地定點(diǎn)編輯。

然而，主流的Cas9和Cas12a酶似乎更擅長單個堿基的定點(diǎn)編輯，在進(jìn)行大規(guī)模刪除DNA的時候顯得“力不從心”。不過10月19日，美國研究人員在《自然·方法》發(fā)表論文稱，他們開發(fā)出一種緊湊型級聯(lián)CRISPR-Cas3系統(tǒng)，可快速準(zhǔn)確地對大規(guī)模DNA片段進(jìn)行刪除。

傳統(tǒng)“魔剪”只能“剪”小片段DNA

CRISPR-Cas系統(tǒng)的類型眾多，目前研究最深入應(yīng)用最成熟的就是CRISPR-Cas9系統(tǒng)。CRISPR-Cas9的結(jié)構(gòu)簡單，能夠很容易地進(jìn)入任何細(xì)胞，并精確地作用于DNA。只需要用目標(biāo)遺傳密碼序列對它進(jìn)行編程，這一工具便能夠掃描整個DNA鏈，找到對應(yīng)部分的基因，在適當(dāng)?shù)奈恢脤⑦@段DNA“剪”開。

“CRISPR-Cas9系統(tǒng)非常適合在明確或者校正某一個基因功能突變的時候，對單個基因進(jìn)行剪輯或者小片段進(jìn)行修改。”南開大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院副院長陳凌懿教授介紹，雖然Cas9可以在需要的地方進(jìn)行剪切，但是只能剪一刀，因此想刪除整個基因位點(diǎn)特別大的DNA片段時，就存在一定局限性。

“就像拆遷房子，如果小區(qū)里只有一幢危樓，那么只需要對這幢危樓進(jìn)行維修或者拆除重建;但是如果要平整土地，或者拆除修補(bǔ)危樓的時候，那就要拆除更多的房子，破壞整個小區(qū)環(huán)境了。”陳凌懿說，拆遷一幢樓不可能大刀闊斧，但是拆遷很多房子就需要更高效的工具了。

陳凌懿進(jìn)一步解釋說：“最近發(fā)現(xiàn)，Cas9產(chǎn)生的‘基因敲除’，通常通過在編碼基因的開放閱讀框中引入小的插入或刪除突變而導(dǎo)致移碼突變，這種方法適用于編碼蛋白質(zhì)的mRNA(信使RNA)。移碼突變是指，3個核苷酸密碼編碼一個氨基酸，當(dāng)刪除的核苷酸數(shù)不是3的整數(shù)倍時，就會導(dǎo)致編碼順序發(fā)生錯位而出現(xiàn)的突變。然而，對非編碼RNA，因?yàn)槠洳⒉痪幋a蛋白質(zhì)，所以不存在移碼突變。此時，就需要采取全基因去除的方法。而哺乳動物的基因，一個基因可能很大，包括外顯子和內(nèi)含子，當(dāng)幾個外顯子相距比較遠(yuǎn)的時候，如果想完整刪除，就需要刪除很大片段DNA。”

對于真核細(xì)胞來說，可大片段刪除DNA的工具將促進(jìn)對大部分非編碼基因片段的詢問，提高對大部分未知功能的編輯效率，它因此將成為一個強(qiáng)大的基因篩選工具。

升級版能“吃掉”大片段DNA

作為“基因魔剪”的CRISPR系統(tǒng)是如何工作的呢?

陳凌懿介紹，CRISPR系統(tǒng)主要由相關(guān)核酸酶(Cas9)和向?qū)NA(gRNA)組成。gRNA能識別出外來侵略者的特定核酸序列，在堿基配對成功后，Cas9蛋白會使識別位點(diǎn)的DNA雙鏈斷裂。隨后生物體自身存在著DNA損傷修復(fù)的應(yīng)答機(jī)制，會將斷裂上下游兩端的序列連接起來，大多數(shù)時候這種連接會引入片段或刪除突變，從而實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞中目標(biāo)基因的敲除。如果在此基礎(chǔ)上為細(xì)胞引入一個修復(fù)的“模板”(供體DNA分子)，這樣細(xì)胞就會按照提供的模板在修復(fù)過程中引入片段插入或定點(diǎn)突變，以此實(shí)現(xiàn)基因的替換或者突變。

此次“升級版”新系統(tǒng)，稱為 CRISPR-Cas3系統(tǒng)，是由進(jìn)行性核酸酶Cas3和其他成分組成的最小版本。該Cas3系統(tǒng)可用來切斷DNA片段，刪除長段DNA。而且它的精度很高，是少有的高質(zhì)量大規(guī)模編輯工具。Cas3系統(tǒng)只需要4個蛋白和1個crRNA，CRISPR-Cas9系統(tǒng)卻需要6個蛋白和1個crRNA，而在基因編輯時，需要將此系統(tǒng)導(dǎo)入到目標(biāo)細(xì)胞中，系統(tǒng)越小，越容易操作。Cas3作為最小的CRISPR系統(tǒng)的一部分，兼具準(zhǔn)確性和可變性，已在銅綠假單胞菌中高效地完成了堿基對數(shù)量高達(dá)424kb的基因組刪除。

“與Cas9剪一刀就完成任務(wù)不同，Cas3系統(tǒng)不僅像一把剪刀，還像‘吃豆人’游戲里的‘大嘴巴’。”陳凌懿介紹，Cas3系統(tǒng)找到特定的DNA靶標(biāo)后，可以先像Cas9一樣剪斷DNA雙鏈，但是和Cas9不同，Cas3將停留在DNA斷點(diǎn)處繼續(xù)吞食DNA，很快就能“吃掉”一大段，最終造成大片段DNA的刪除。

“之所以可以變身‘吃豆人’，與Cas3的DNA酶特性有關(guān)，其亞單位比Cas9多一些，有結(jié)構(gòu)可以結(jié)合到DNA上。”陳凌懿解釋說，就相當(dāng)于只有抓住繩子末端，才可以沿著繩子往前走。雖然Cas3和Cas9識別DNA特異序列的方式是一樣的，但是識別之后，剪切的方式是不一樣的。Cas3系統(tǒng)既有手的功能，能錨定在DNA的位點(diǎn)上，同時又有“吃豆人”的功能，不斷把DNA“吃”下去。

未來在工業(yè)發(fā)酵領(lǐng)域應(yīng)用價值大

CRISPR系統(tǒng)目前主要應(yīng)用于腫瘤、遺傳等疾病的治療方面。此次CRISPR-Cas3系統(tǒng)的出現(xiàn)，其高效率和高精度是否能讓CRISPR系統(tǒng)的應(yīng)用更加廣闊?

“在CRISPR-Cas9系統(tǒng)中存在的脫靶效應(yīng)，在大片段刪除系統(tǒng)中同樣存在這樣的風(fēng)險。而且大片段刪除還增加另一個風(fēng)險，就是可否準(zhǔn)確地控制刪除的長度。”陳凌懿對CRISPR-Cas3系統(tǒng)刪除基因的精準(zhǔn)性提出了質(zhì)疑?？茖W(xué)家在實(shí)驗(yàn)室可以篩選出準(zhǔn)確刪除目標(biāo)基因的細(xì)胞;但是在臨床應(yīng)用中，可能會面臨更多的問題和挑戰(zhàn)。另外，目前的工作只證明了CRISPR-Cas3系統(tǒng)在細(xì)菌中起作用，能否在高等生物特別是哺乳動物中應(yīng)用CRISPR-Cas3系統(tǒng)進(jìn)行大片段DNA的刪除，還有待證明。

“此外，在臨床上，患者進(jìn)行治療時，我們檢測到某一個基因突變了，要定點(diǎn)把突變基因修復(fù)，這需要進(jìn)行精準(zhǔn)編輯。”陳凌懿認(rèn)為，如果大片段刪除基因，就是一種大規(guī)模的破壞性治療，不符合臨床小規(guī)模、小修復(fù)的治療原則，這種案例非常少見。而且以目前我們對編碼或是非編碼基因的了解，大片段刪除或引入還有很多未知數(shù)，因此很可能病沒治好，反而增添了新病。

“雖然說目前應(yīng)用于臨床還有一定難度，但CRISPR-Cas3還可以在工業(yè)、農(nóng)業(yè)中發(fā)揮作用。”陳凌懿表示，比如工業(yè)發(fā)酵，所使用的菌種基因組越大，整個發(fā)酵過程中真正合成目標(biāo)產(chǎn)物就越低效。“因此在進(jìn)行工業(yè)發(fā)酵的時候，我們選擇菌種希望越簡單越好，除了菌種存活所必需的基因外，最好就一個酶。”陳凌懿說，把系統(tǒng)簡化的時候相當(dāng)于把菌種里不需要的基因去掉，在最小基因組的細(xì)菌當(dāng)中，引入新的基因。這種做減法的過程就可以使用CRISPR-Cas3系統(tǒng)進(jìn)行大片段刪除來完成。如果DNA刪多了，菌種可能就死掉了，只有刪得合適了，才能得到基因組被簡化的活菌種。

本報記者 陳 曦

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